คำอธิบาย

พารามิเตอร์ทางเทคนิค

แนะนำผลิตภัณฑ์

ชื่อสินค้า	แมว. เลขที่	ข้อมูลจำเพาะ
ชุดภูมิคุ้มกัน (โปรตีน A Agarose)	G2215-50T	50 T

รายละเอียดสินค้า/บทนำ

IP หรือ Co-IP เป็นเทคนิคการทดลองทั่วไปสำหรับการศึกษาปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนหรือโปรตีน-โปรตีน (PPI) โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะและตัวกลางที่จับแอนติบอดี (เช่น โปรตีน A/G Agarose หรือโปรตีน A/G Magrose) หรือใช้โดยตรง ตัวกลางควบคู่กับแอนติบอดีจำเพาะ (เช่น อะกาโรสหรือเม็ดแม่เหล็ก) แล้วจึงแยกสารเชิงซ้อนของแอนติเจน-แอนติบอดีออกจากตัวอย่างโปรตีนที่ซับซ้อนโดยการปั่นแยกหรือแรงแม่เหล็ก เพื่อให้บรรลุวัตถุประสงค์ของการแยกและ การทำให้โปรตีนเป้าหมายบริสุทธิ์ ซึ่งต่อมาสามารถนำมาใช้สำหรับเวสเทิร์นบล็อตหรือแมสสเปกโตรเมตรี โปรตีน A เป็นโปรตีนที่ผนังเซลล์ที่พบใน Staphylococcus aureus โดยมีน้ำหนักโมเลกุล 42 kDa โปรตีน G คือโปรตีนที่ยึดจับอิมมูโนโกลบุลินที่แสดงโดยแบคทีเรียสเตรปโตคอกคัสชนิด C หรือ G โปรตีน A และโปรตีน G มีการทำงานคล้ายคลึงกันและสามารถจับโดยเฉพาะกับอิมมูโนโกลบุลิน (Ig) ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รีคอมบิแนนท์โปรตีน A และ G ที่มีการดัดแปลงที่เหมาะสมที่จับกับอะกาโรสสามารถถูกใช้สำหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการทำให้แอนติบอดีบริสุทธิ์ โปรตีน A อะกาโรสเหมาะสำหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันของ IgG1, IgG2, IgG4, IgG2a ของหนูเมาส์, IgG2b ของมนุษย์ ในขณะที่เม็ดบีดของโปรตีน G อะกาโรสเหมาะสำหรับการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันของ IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, หนูเมาส์ IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, หนู IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c โพลีโคลนอลแอนติบอดี (ดูตารางที่ 1 สำหรับข้อมูลเฉพาะ)

ผลิตภัณฑ์นี้ใช้อะกาโรสที่มีป้ายกำกับว่าโปรตีน A ที่พัฒนาตนเองและผลิตขึ้นเอง เมื่อเปรียบเทียบกับผลิตภัณฑ์ที่คล้ายคลึงกันในตลาด ผลิตภัณฑ์นี้จับแอนติบอดีได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นและมีอัตราการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจงต่ำกว่า เมื่อใช้ร่วมกับบัฟเฟอร์ที่ปรับให้เหมาะสมแล้ว จะสะดวกและมีประสิทธิภาพ สำหรับการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน มันสามารถนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนเป้าหมายในตัวอย่างเช่นเซลล์ไลเซต, ส่วนลอยเหนือตะกอนของการหลั่งของเซลล์, ซีรั่ม, น้ำในช่องท้อง ฯลฯ ชุดนี้มีวิธีชะสองวิธี (การชะล้างแบบเสียสภาพและการชะกรด) เพื่อชะล้างโปรตีนเป้าหมาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งการชะกรดจะไม่มีสายโซ่เบาและหนักของแอนติบอดี ซึ่งสามารถแก้ปัญหาการรบกวนของแอนติบอดีหนักและเบาได้อย่างมีประสิทธิภาพ โซ่ในการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันและโปรตีนอิมมูโนล็อตติง

ข้อมูลผลิตภัณฑ์

ลักษณะเฉพาะ	คำอธิบาย
เนื้อหาผลิตภัณฑ์	อะกาโรส 50%(ปริมาตร/ปริมาตร) ในบัฟเฟอร์ป้องกันจำเพาะ
โครงสร้างลูกปัด	อะกาโรสเชื่อมโยงข้าม 6%
โปรตีนคู่กัน	โปรตีนเอ
เมกะวัตต์ของโปรตีน	~25 กิโลดาลตัน (โปรตีน เอ)
ความสามารถในการจับโปรตีน	>แอนติบอดีของเมาส์ 1 มก. ต่อเม็ดบีด 1 มล
ความจำเพาะ	แอนติบอดีจากสายพันธุ์ต่างๆ รวมถึงหนู คน หนู แพะ แกะ และวัวควาย
เส้นผ่านศูนย์กลางลูกปัด	30~150 μm
วิธีการชะล้าง	การชะด้วยกรดหรือบัฟเฟอร์การโหลด SDS‐PAGE 1x (ลดลง) หมายเหตุ: หากชะด้วยบัฟเฟอร์การโหลด SDS‐PAGE 1x (ลดลง) สายหนัก (~ 50kDa) และสายเบา (~ 25kDa) ของแอนติบอดีจะถูกทำให้เสียสภาพและปล่อยออกจากเม็ดบีดอะกาโรส
การใช้งาน	IP, Co-IP, การทำโปรตีนให้บริสุทธิ์

เงื่อนไขการจัดเก็บและการจัดส่ง

จัดส่งด้วยน้ำแข็งเปียก 5×บัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE (ลดลง) ควรเก็บไว้ที่ -20 องศา และอื่นๆ ที่ 2-8 องศา เป็นเวลา 12 เดือน

ส่วนประกอบของผลิตภัณฑ์

หมายเลขส่วนประกอบ	ส่วนประกอบ	G2215-50T	อุณหภูมิในการจัดเก็บ
G2038	บัฟเฟอร์การแยก IP	50 มล	2-8 องศา
G0015	10×ทีบีเอส	5 มล	2-8 องศา
G2215-1	สวีอะกาโรส โปรตีน เอ	1 มล	2-8 องศา
G2215-2	บัฟเฟอร์การชะล้างกรด	10 มล	2-8 องศา
G2215-3	บัฟเฟอร์การชะล้าง Neulization	1 มล	2-8 องศา
G2013	5x บัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE (ลดลง)	1 มล	-20 องศา
คู่มือ		1 ชิ้น

จำเป็นต้องมีรีเอเจนต์เพิ่มเติม

ชื่อสินค้า	แมว. ตัวเลข	ข้อมูลจำเพาะ
50×ตัวยับยั้งโปรตีเอสค็อกเทล	ก2006-250UL	250 μL
PBS,1×(น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต)	ก4202-500มล	500 มล

ระเบียบวิธี/ขั้นตอนการทดสอบ

1. การเตรียมชุดอุปกรณ์

a) โปรดดูตารางด้านล่าง เตรียมรีเอเจนต์ที่เกี่ยวข้องในอัตราส่วนไลเซต 100-500 ไมโครลิตรต่อตัวอย่าง

ขั้นตอน	จำเป็นต้องมีวิธีแก้ปัญหา	ปริมาณ	ปริมาณ
การสลายเซลล์และการเตรียมการ	IP lysate ที่มีสารยับยั้งค็อกเทลโปรตีเอส	100 μL	500 μL
ไอพี	สวีอะกาโรส โปรตีน เอ	4 μL	20 μL
ล้างสามครั้ง	1×ทีบีเอส	100 μL	500μL
การชะล้างกรดและการทำให้เป็นกลาง	บัฟเฟอร์การชะล้างกรด	20 μL	100 μL
การชะล้างกรดและการทำให้เป็นกลาง	บัฟเฟอร์การวางตัวเป็นกลาง	20 μL	100 μL
การชะละลาย	1x บัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE (ลดลง)	20 μL	100 μL

b) การเตรียม IP lysate ที่มี protease inhibitor: โปรดดูตารางด้านบน ใช้ {{0}} μL ของ IP lysate ที่มี protease inhibitor ต่อ 0.5-1 ล้านเซลล์สำหรับการสลาย ผสม IP ไลเซตกับ 50x Cocktail protease inhibitor (แนะนำให้ใช้ G2006-250UL) ในอัตราส่วน 50:1 เช่น เติม 20 μL ของ 50x Cocktail protease inhibitor ลงใน IP lysate 1 มล. จากนั้นจึงเติม 1 มล. จะได้รับ IP lysate ที่มีตัวยับยั้งโปรตีเอส ควรวาง IP lysate ที่เตรียมไว้ซึ่งมีสารยับยั้งไว้ในอ่างน้ำแข็งหรือที่อุณหภูมิ 4 องศา

c) หมายเหตุ: หากโปรตีนเป้าหมายของการกระตุ้นภูมิคุ้มกันเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงฟอสโฟรีเลชั่นหรืออะซิติเลชั่น ควรเติมสารยับยั้งฟอสฟาเตสหรือสารยับยั้งดีอะซิติเลส (จัดเตรียมเอง) ควรเตรียมยาที่มีสารยับยั้ง IP lysate ก่อนใช้ และไม่ควรแช่แข็งและเก็บไว้เพื่อใช้ในภายหลัง

d) การเตรียม 1×TBS: เจือจางบัฟเฟอร์ 10×TBS ด้วยน้ำบริสุทธิ์พิเศษให้เป็น 1×TBS ตัวอย่างเช่น เติมบัฟเฟอร์ 10×TBS 1 มิลลิลิตรลงในน้ำบริสุทธิ์พิเศษ 9 มิลลิลิตร ซึ่งเท่ากับบัฟเฟอร์ 1×TBS หลังจากผสมให้เข้ากัน

e) การเตรียมบัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE 1x (ลดลง): ปริมาณที่เหมาะสมของบัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE 5x (ลดลง) ถูกเจือจาง 5 เท่าด้วยน้ำบริสุทธิ์พิเศษเพื่อสร้างบัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE 1x (ลดลง); ตัวอย่างเช่น ผสม 0.2 มล. ของบัฟเฟอร์โปรตีน 5x (ลดลง) กับน้ำบริสุทธิ์พิเศษ 0.8 มล. ซึ่งเป็นบัฟเฟอร์การโหลด SDS-PAGE 1x (ลดลง)

2. การเตรียมตัวอย่างแอนติเจน

การทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันควรดำเนินการทันทีหลังจากที่ตัวอย่างถูกแยกออก หากไม่เป็นเช่นนั้น สามารถเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ -20 องศาหรือ -80 องศา แต่การแช่แข็งและการละลายอาจส่งผลต่อปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและโปรตีน ขั้นตอนการสลายตัวอย่างทั้งหมดควรดำเนินการในอ่างน้ำแข็งหรือที่ 4 องศา เพื่อลดการสลายตัวของโปรตีน และควรใช้ตัวอย่างจำนวนหนึ่งเป็นข้อมูลเข้าหรือผลรวมหลังจากที่ตัวอย่างได้เตรียมไว้สำหรับการตรวจจับในภายหลังโดย เวสเทิร์นบล็อท

สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ:

ก) ควรล้างเนื้อเยื่อใน PBS ก่อนเย็น (แนะนำ G4202) เพื่อขจัดเลือดส่วนเกินออกอย่างทั่วถึง ชั่งน้ำหนักและสับเป็นชิ้นเล็ก ๆ ในโฮโมจีไนเซอร์บนน้ำแข็ง

b) เพิ่ม IP lysate ที่มีตัวยับยั้งโปรตีเอสในอัตราส่วน 100-200 μL ต่อ 10-20 มก. ของเนื้อเยื่อ หรือลดปริมาณของ IP lysate หากต้องการความเข้มข้นของโปรตีนที่สูงขึ้น

c) ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องโฮโมจีไนเซอร์แบบแก้วหรือโฮโมจีไนเซอร์แบบมือถือ หรือใช้เครื่องเจียรอุณหภูมิต่ำ KZ-III-F ที่พัฒนาขึ้นเองของเราเพื่อการบดแบบเต็ม

d) โฮโมจีเนตถูกถ่ายโอนไปยังหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 1.5 มล. เขย่าและผสม และอาบในน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที เป่าซ้ำด้วยปิเปตทุกๆ 10 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์เนื้อเยื่อสลายโดยสมบูรณ์

e) ปั่นแยกที่ 12,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศา ทิ้งตะกอนและส่วนที่ลอยออกไปสำหรับการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันในภายหลัง

สำหรับตัวอย่างเซลล์สานุศิษย์:

ก) หากจำเป็น สามารถล้างเซลล์ได้ 2-3 ครั้งด้วย PBS และดูดซับของเหลวที่ตกค้างอย่างทั่วถึงในครั้งสุดท้าย

b) ขูดเซลล์ด้วยที่ขูดเซลล์หรือทริปซินย่อยเซลล์เพื่อให้เซลล์ลอยตัวเต็มที่ เก็บเซลล์เหล่านั้นลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 1.5 มล. และปั่นแยกที่ 1,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศา ทิ้งส่วนเหนือตะกอนไป สะสมตะกอนของเซลล์

c) เพิ่ม {{0}} μL ของ IP ไลเซตที่มีตัวยับยั้งโปรตีเอสต่อ 0.5-1 ล้านเซลล์ (เทียบเท่ากับหนึ่งหลุมของเพลตหลุม 6-); เป่าอย่างเหมาะสมและแช่ในน้ำแข็งเป็นเวลา 3-5 นาทีเพื่อให้เซลล์สลายตัวจนหมด และไม่ควรมีการตกตะกอนของเซลล์อย่างชัดเจนหลังจากสลายเซลล์จนเต็มที่ หากจำนวนเซลล์มีขนาดใหญ่ขึ้น แนะนำให้แบ่งเซลล์ออกเป็น 0.5-1 ล้านเซลล์/หลอดเพื่อสลายอย่างสมบูรณ์

d) หลังจากการสลายที่เพียงพอ ปั่นแยกที่ 12,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศา ทิ้งตะกอนและสารลอยเหนือตะกอนออกไปสำหรับการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันในภายหลัง

สำหรับตัวอย่างเซลล์แขวนลอย:

ก) ปั่นแยกที่ 1,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศาเพื่อรวบรวมตะกอน หากจำเป็น ให้ล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง จากนั้นดูดของเหลวที่ตกค้างและค่อยๆ หมุนวนเพื่อกระจายเซลล์ให้มากที่สุด

b) เพิ่ม {{0}} μL ของ IP ไลเซตที่มีตัวยับยั้งโปรตีเอสต่อ 0.5-1 ล้านเซลล์ (เทียบเท่ากับหนึ่งหลุมของเพลตหลุม 6-); เป่าอย่างเหมาะสมและแช่ในน้ำแข็งเป็นเวลา 3-5 นาทีเพื่อให้เซลล์สลายตัวเต็มที่ หากจำนวนเซลล์มีขนาดใหญ่ขึ้น แนะนำให้แบ่งเซลล์ออกเป็น 0.5-1 ล้านเซลล์/หลอดเพื่อสลายอย่างสมบูรณ์

ค) แช่น้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที ปั่นแยกที่ 12000 กรัม 4 องศาเป็นเวลา 5 นาที นำส่วนลอยเหนือตะกอน ซึ่งก็คือสารละลายโปรตีนทั้งหมด ซึ่งสามารถนำไปใช้สำหรับการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันในภายหลัง และอื่นๆ

สำหรับตัวอย่างแบคทีเรียหรือยีสต์:

ก) นำสารละลายแบคทีเรียหรือยีสต์ 1 มล. มาปั่นแยกเพื่อกำจัดส่วนลอยเหนือตะกอนออก หากจำเป็นสามารถล้างเซลล์ด้วย PBS หนึ่งครั้ง และดูดซับของเหลวที่ตกค้างได้อย่างทั่วถึงในครั้งสุดท้าย ค่อยๆ หมุนวนหรือสะบัดด้านล่างของหลอดเพื่อกระจายเซลล์ให้มากที่สุด

b) เติม IP ไลเซต 100-200 μL ที่มีตัวยับยั้งโปรตีเอส และเป่าเบาๆ เพื่อกระจายแบคทีเรียหรือเชื้อราจนหมด

c) แช่ในน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที เพื่อการสลายที่ดีขึ้น แบคทีเรียและยีสต์สามารถย่อยด้วยไลโซไซม์และเอนไซม์ทำลายผนัง (จัดเตรียมเอง) ตามลำดับ จากนั้น lysed ด้วย IP ไลเซตที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส

d) ปั่นแยกที่ 12,000 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศา ทิ้งตะกอนและส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันหรือการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันในภายหลัง

3. การเตรียมอะกาโรส

a) ค่อยๆ แขวนเม็ดบีด SweAgarose Protein A อีกครั้งเพื่อสร้างการกระจายตัวของเม็ดบีดที่เป็นเนื้อเดียวกันมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ เติมเม็ดบีดที่ผสมกันอย่างดี 20 ul สำหรับตัวอย่างทุกๆ 500 ul นำเม็ดบีด agarose ในปริมาณที่เหมาะสมไปใน ทำความสะอาดหลอด EP และเติม 1x TBS ลงในปริมาตรสุดท้ายที่ 0.5 มล. (การกระจายตัวของเม็ดบีด 20 ul สำหรับแต่ละตัวอย่างใช้ในการตกตะกอนภูมิคุ้มกันต่อไปนี้ ขั้นตอนเป็นตัวอย่าง)

b) ค่อย ๆ แขวนเม็ดบีดอีกครั้ง ปั่นแยกที่ 6,000×g เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4 องศา ค่อย ๆ เอาส่วนที่ลอยเหนือตะกอนออก และทำซ้ำขั้นตอนข้างต้นสองครั้ง

c) เม็ดบีดถูกแขวนลอยอีกครั้งด้วย 1x TBS ตามปริมาตรของการกระจายตัวของเม็ดบีดเริ่มต้น

4. แอนติบอดีจับกับเม็ดบีด SweAgarose Protein A

ก) การเตรียมแอนติบอดี: เจือจางแอนติบอดีด้วย 1x TBS เพื่อเตรียมสารละลายการทำงานของแอนติบอดีตามอัตราส่วนการเจือจางที่แนะนำในคำแนะนำของแอนติบอดี หรือเตรียมแอนติบอดีลงในสารละลายการทำงานของแอนติบอดีด้วยความเข้มข้นสุดท้ายที่ 5-50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งสามารถเตรียมได้บนน้ำแข็ง ทางเลือก: ใช้ IgG ปกติของแอนติบอดีสายพันธุ์เดียวกันเพื่อเตรียมสารละลายการทำงานของ IgG ปกติด้วยอัตราส่วนการเจือจางหรือความเข้มข้นสุดท้ายที่เท่ากันที่ 5-50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ลบการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจงออก หรือทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบ IgG ปกติของสปีชีส์เดียวกันหมายความว่าถ้าแอนติบอดีที่ใช้ในการตกตะกอนภูมิคุ้มกันในเวลาต่อมาคือ IgG ของหนูเมาส์ ปริมาณ IgG ปกติของหนูเมาส์ที่เหมาะสมสามารถเจือจางด้วย 1x TBS ในขั้นตอนนี้เพื่อลดพื้นหลังหรือเป็นตัวควบคุมเชิงลบ

b) การดูดซับแอนติบอดี: แยกเม็ดบีด SweAgarose Protein A ที่เตรียมไว้ในขั้นตอนที่ 3 โดยการปั่นแยกที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4 องศา ดูดส่วนลอยเหนือตะกอน เติมสารละลายการทำงานของแอนติบอดี 500 ไมโครลิตรหรือสารละลายการทำงานของ IgG ปกติ แล้วแขวนลอยใหม่ จากนั้นบ่มเป็นเวลา 15-60 นาทีที่อุณหภูมิห้องบนเครื่องผสมหมุนเวียน

หมายเหตุ: นอกจากนี้ยังสามารถฟักเม็ดบีด SweAgarose Protein A ที่เตรียมในขั้นตอนที่ 3 โดยตรงด้วยแอนติบอดีหรือ IgG ปกติในปริมาณที่เหมาะสมได้

c) การแยกและการล้างเม็ดบีด: แยกเม็ดบีดที่บ่มแล้วด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4 องศา ดูดส่วนลอยเหนือตะกอน เติม 500 μL ของ 1×TBS จากนั้นแขวนเม็ดบีด SweAgarose Protein A อีกครั้งโดยเป่าเบาๆ ด้วย ปิเปต ปั่นแยกที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาที ที่ 4 องศา เอาส่วนเหนือตะกอนออก ทำซ้ำ ซักสามครั้ง และแขวนเม็ดบีดอีกครั้งด้วย 1×TBS ในปริมาณเดียวกันกับปริมาตรเริ่มต้น

หมายเหตุ: หากเม็ดบีดจับตัวเป็นก้อนหรือเป็นขุยระหว่างการฟักตัวและการซัก ถือเป็นปรากฏการณ์ปกติและจะไม่ส่งผลกระทบต่อผลการทดลอง

5. ภูมิคุ้มกันบกพร่อง (IP):

a) การกำจัดการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจง (เป็นทางเลือก): เม็ดบีด SweAgarose Protein A ที่เตรียมในขั้นตอนที่ 4 ซึ่งจับ IgG ปกติ ถูกบ่มด้วยตัวอย่างที่ 4 องศาเป็นเวลา 60 นาที และแยกจากกันด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาที ที่ 4 องศา และใช้ส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการทดลองครั้งต่อไป จุดประสงค์ของขั้นตอนนี้คือเพื่อกำจัดโปรตีนที่จับกับ IgG ปกติแบบไม่เฉพาะเจาะจง

b) การฟักตัวของตัวอย่างด้วยเม็ดบีด SweAgarose Protein A ที่คอนจูเกตกับแอนติบอดีหรือ IgG ปกติ: เติมเม็ดบีด SweAgarose Protein A ที่คอนจูเกตกับแอนติบอดีหรือ IgG ปกติในอัตราส่วน 20 ul ของสารแขวนลอยของเม็ดบีดสำหรับตัวอย่างโปรตีนทุกๆ 500 ul โดยวางไว้ด้านข้าง เชคเกอร์แบบสั่นหรือเครื่องผสมแบบหมุน และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C

หมายเหตุ 1: หากเม็ดบีดจับตัวเป็นก้อนหรือเป็นขุยระหว่างการฟักตัวและการล้าง ถือเป็นปรากฏการณ์ปกติและจะไม่ส่งผลกระทบต่อผลการทดลอง

หมายเหตุ 2: อีกทางหนึ่ง ปริมาณที่เหมาะสมของแอนติบอดีหรือ IgG ปกติสามารถบ่มด้วยตัวอย่างเป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือข้ามคืนที่ 4 องศา จากนั้นจึงเติมสารแขวนลอยอะกาโรสบีด 10-20 ไมโครลิตรได้ และบ่มเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง

c) การหมุนเหวี่ยง: หลังจากการฟักตัว หมุนเหวี่ยงที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาที ที่ 4 องศา เพื่อเอาส่วนที่ลอยอยู่เหนือตะกอนออก

หมายเหตุ: เก็บส่วนที่ลอยเหนือตะกอนไว้เพื่อทดสอบผลของการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน

d) การล้าง: เติม 1×TBS 500 ul ค่อยๆ เป่าเม็ดบีดที่แขวนลอยใหม่ด้วยปิเปต ปั่นแยกที่ 6,000 xg เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 4 องศา เพื่อเอาส่วนลอยเหนือตะกอนออก และล้างซ้ำสามครั้ง

หมายเหตุ: คุณยังสามารถทดสอบ OD280 ของบัฟเฟอร์การซักเพื่อตรวจสอบว่าการซักเสร็จสมบูรณ์หรือไม่ หาก OD280 มากกว่า 0.05 ควรเพิ่มจำนวนเวลาในการซักอย่างเหมาะสม

6. การชะล้าง

ขึ้นอยู่กับคุณลักษณะของโปรตีนเป้าหมายและข้อกำหนดของการทดลองครั้งต่อไป สามารถเลือกวิธีใดวิธีหนึ่งต่อไปนี้สำหรับการชะ

ก) วิธีการชะล้างแบบเสียสภาพ: ตัวอย่างที่ชะด้วยวิธีนี้เหมาะสำหรับ SDS-PAGE เติมบัฟเฟอร์สุ่มตัวอย่างโปรตีน 1× 25 µL (แบบลดลง) ลงในหลอดหลังจากปั่นแยก ให้ความร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นจึงปั่นแยกเพื่อรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการตรวจจับเวสเทิร์นบล็อต

b) การชะล้างกรด: ตัวอย่างที่ถูกชะด้วยวิธีนี้จะคงฤทธิ์ทางชีวภาพดั้งเดิมไว้ และสามารถนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์หลังการทำงานได้ เติมบัฟเฟอร์การชะล้างกรด 20 ไมโครลิตรลงในหลอดหลังจากการปั่นแยก ผสมให้เข้ากันและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นปั่นแยกเพื่อรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนลงในหลอด EP ใหม่ และเติมบัฟเฟอร์การชะล้าง Neulization 2 µL ทันทีเพื่อปรับ pH ของ ผลิตภัณฑ์ที่ถูกชะออกมาจนเป็นกลาง ซึ่งสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์หลังการทำงานได้

หมายเหตุ: ผู้ใช้สามารถปรับปริมาณบัฟเฟอร์การชะล้างที่เพิ่มตามปริมาตรที่ต้องการได้

บันทึก

1. อย่าเก็บ SweAgarose Protein A ในชุดอุปกรณ์ที่อุณหภูมิ -20 องศา หรือแช่แข็งและละลายซ้ำๆ มิฉะนั้นจะส่งผลต่อประสิทธิภาพของเม็ดแม่เหล็กและทำให้เกิดข้อผิดพลาดในการทดลองโดยไม่จำเป็น

2. โปรดอ่านคำแนะนำเหล่านี้อย่างละเอียดก่อนดำเนินการตามขั้นตอนการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน

3. หากโปรตีนเป้าหมายที่มีการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงฟอสโฟรีเลชั่นหรืออะซิติเลชั่น ควรจัดให้มีสารยับยั้งฟอสฟาเตสและสารยับยั้งดีอะซิติเลสที่เหมาะสม

4. รักษาเม็ดบีดไว้ที่ pH 6-8 หลีกเลี่ยงการปั่นแยกด้วยความเร็วสูง ทำให้แห้ง หรือการแช่แข็ง ซึ่งอาจทำให้เกิดการรวมตัวของเม็ดบีด

5. ควรผสมเม็ดบีดให้ละเอียดก่อนใช้งาน การผสมควรอ่อนโยนและไม่ควรหมุนวนและเขย่าอย่างรุนแรงเพื่อหลีกเลี่ยงการเสียสภาพของแอนติบอดี

6. แนะนำให้ใช้การควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ (SweAgarose Mouse IgG) ในการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน

7. ตัวอย่างโปรตีนควรได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยเร็วที่สุดหลังการเก็บตัวอย่าง และวางไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาหรือในอ่างน้ำแข็งเสมอเพื่อชะลอการย่อยสลายหรือทำให้โปรตีนเสื่อมสภาพ

8. เม็ดอะกาโรสอาจรวมตัวกันเมื่อใช้กับการชะล้างกรด ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ปกติ และไม่ส่งผลกระทบต่อการใช้งานปกติของเม็ดแม่เหล็ก

9. ผลิตภัณฑ์นี้จำกัดเฉพาะการใช้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์โดยผู้เชี่ยวชาญ และห้ามใช้เพื่อการวินิจฉัยทางคลินิกหรือการรักษา อาหารหรือยา หรือเก็บไว้ในที่อยู่อาศัยทั่วไป

10. สวมชุดป้องกันที่เหมาะสม เช่น ชุดห้องปฏิบัติการ แว่นตานิรภัย และถุงมือ

11. ความสามารถในการจับของโปรตีน A และโปรตีน G กับแอนติบอดีของแหล่งทั่วไปและชนิดย่อยที่แตกต่างกันแสดงไว้ในตารางที่ 1

ตารางที่ 1

สายพันธุ์	ไอจี	โปรตีนเอ	โปรตีนจี	รวมไอจี	โปรตีนเอ	โปรตีนจี
มนุษย์	ไอจีจี 1	++++	++++	มนุษย์	++++	++++
	ไอจีจี 2	++++	++++	หนู	+++	+++
	ไอจีจี 3	-	++++	หนู	+/-	++
	ไอจีจี 4	++++	++++	กระต่าย	++++	+++
	ไอจีเอ	++	-	แพะ	-	++
	ไอจีดี	++	-	ไก่	-	+
	ไอจีอี	++	-	วัว	++	++++
	ไอจีเอ็ม	++	-	หนูตะเภา	++++	++
หนู	ไอจีจี 1	+	++++	หนูแฮมสเตอร์	+	++
	ไอจีจี 2 เอ	++++	++++	ม้า	++	++++
	ไอจีจีทูบี	+++	+++	หมู	+++	+++
	ไอจีจี 3	++	+++	แกะ	+/-	++
	ไอจีเอ็ม	+/-	-	++++:ปิงผู้แข็งแกร่ง
หนู	ไอจีจี 1	-	+	++~+++:การเข้าเล่มปานกลาง
	ไอจีจี 2 เอ	-	++++	+:การผูกมัดที่อ่อนแอ
	ไอจีจีทูบี	-	++	+/-:อ่อนหรือไม่มีการผูกมัด
	ไอจีจีทูซี	+	++	-:ไม่มีการผูกมัด
	ไอจีเอ็ม	+/-	-

สำหรับใช้ในการวิจัยเท่านั้น ไม่ใช้สำหรับขั้นตอนการวินิจฉัยหรือการรักษา!

ป้ายกำกับยอดนิยม: ชุดภูมิคุ้มกันบกพร่อง (โปรตีนอะกาโรส) ประเทศจีน ผู้ผลิตชุดภูมิคุ้มกันบกพร่อง (โปรตีนอะกาโรส) ซัพพลายเออร์ โรงงาน

ชุดภูมิคุ้มกัน (โปรตีน A Agarose)