ชุดทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของ LDH

 

ชื่อสินค้า	แมว. เลขที่	ข้อมูลจำเพาะ
ชุดทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของ LDH	G1610-100T	100T

 

 

แลคเตตดีไฮโดรจีเนส (LDH) เป็นเอนไซม์ปลายทางของวิถีไกลโคไลติก พบกันอย่างแพร่หลายในสัตว์ พืช และจุลินทรีย์ และมีส่วนเกี่ยวข้องในการเร่งปฏิกิริยาปฏิกิริยาที่ผันกลับได้ระหว่างไพรูเวตและแลคเตต โดยปกติ LDH มีมากมายในไซโตพลาสซึมของเซลล์ และเซลล์ปกติไม่สามารถผ่าน LDH ภายในเซลล์ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างอิสระ เนื่องจากมีการป้องกันสิ่งกีดขวางของเยื่อหุ้มเซลล์ อย่างไรก็ตาม เมื่อเซลล์เสียหายหรือตาย การป้องกันสิ่งกีดขวางของเยื่อหุ้มเซลล์จะหายไป และ LDH ภายในเซลล์จะถูกปล่อยออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ ความเป็นพิษต่อเซลล์สามารถวัดปริมาณได้โดยการตรวจจับปริมาณ LDH ที่ปล่อยออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อโดยการแตกของเยื่อหุ้มเซลล์

 

หลักการสำคัญของชุดตรวจจับความเป็นพิษต่อเซลล์ของแลคเตตดีไฮโดรจีเนส (LDH) คือการใช้ LDH เพื่อลด NAD+ ให้เป็น NADH และเพิ่มเติม NADH และ INT (เกลือเตตราโซเลียม) เร่งปฏิกิริยาด้วยไดอะโฟเรส (ไลโปอิกแอซิดดีไฮโดรจีเนส) เพื่อสร้าง NAD+ และสิ่งสกปรกสีแดง ซึ่งเป็นปริมาณของสิ่งสกปรก ที่ผลิตได้และปริมาณของ LDH เป็นความสัมพันธ์เชิงเส้น และสามารถสร้างค่าการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ 490 นาโนเมตร การดูดซับสูงสุดที่ 490 นาโนเมตร จึงสามารถวิเคราะห์เชิงปริมาณด้วยเครื่องมือได้ ชุดนี้ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการตรวจวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์โดยยึดตามการปล่อย LDH เป็นตัวบ่งชี้ แต่ยังสามารถใช้เพื่อตรวจการเพิ่มจำนวนเซลล์และการตรวจวิเคราะห์ความเป็นพิษโดยยึดตาม LDH ของเซลล์ทั้งหมด

 

 

จัดส่งด้วยน้ำแข็งเปียก เก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาได้นานถึง 12 เดือน หลีกเลี่ยงการละลายน้ำแข็งของสารละลายเอนไซม์ซ้ำๆ INT Solution ควรได้รับการปกป้องจากแสง

 

 

หมายเลขส่วนประกอบ	ส่วนประกอบ	G1610-100T
G1610-1	บัฟเฟอร์สลายเซลล์ 10 เท่า	1.5 มล
G1610-2	พื้นผิวปฏิกิริยา	2×1 มล
G1610-3	ไอเอ็นที โซลูชั่น	200 μL
G1610-4	สารละลายเอนไซม์	2×150 μL
G1610-5	บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา	10 มล
คู่มือ		หนึ่งสำเนา

 

 

1. การเตรียมตัวอย่าง:

1) การตรวจหา LDH ภายนอกเซลล์

ก. การเพาะเซลล์: เพาะเซลล์เมล็ดในแผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์ในหลุม 96- ในช่วงเวลาที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับประเภทของเซลล์ จุดบรรจบกันของเซลล์ที่จะทดสอบควรเกิน 80-90% และสามารถตั้งค่าการควบคุมได้หลายแบบตามความต้องการในการทดลอง

การควบคุมพื้นหลัง: มีสื่อการเพาะเลี้ยงเท่านั้นและไม่มีเซลล์

การควบคุมตัวอย่าง:ประกอบด้วยสื่อการเพาะเลี้ยงและเซลล์ หลุมเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัด

ตัวอย่างการควบคุมการทำงานของเอนไซม์สูงสุด: ประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อและเซลล์ การตรวจหา LDH ในเซลล์ทั้งหมดหลังจากการสลายเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัด

ตัวอย่างที่ได้รับการบำบัด (กลุ่มทดลอง): ตามวิธีการที่ต้องการ ให้บำบัดเซลล์ด้วยยาที่เหมาะสมที่ความเข้มข้นต่างกัน

ข. การบำบัดเซลล์: นำตัวกลางเพาะเลี้ยงออกและล้างเซลล์หนึ่งครั้งด้วยสารละลาย PBS (แนะนำ G4202) เพิ่มอาหารเลี้ยงเชื้อสด (อาหารเพาะเลี้ยงที่มีซีรั่มต่ำ อาหารเลี้ยงเชื้อแบบไม่มีซีรั่ม หรืออาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยยา) ลงในแต่ละหลุม ฟักเป็นระยะเวลาหนึ่ง

ค. การเก็บตัวอย่าง: ปั่นแยกแผ่นเพาะเซลล์ที่ 1,000×g เป็นเวลา 5 นาที ถ่ายโอนส่วนลอยเหนือตะกอน 80 ไมโครลิตรจากแต่ละหลุมไปยังเพลตหลุม 96- ใหม่ หลังจากนั้นตัวอย่างจะถูกวิเคราะห์ การเตรียมตัวอย่างสำหรับหลุมควบคุมที่มีการทำงานของเอนไซม์สูงสุดของตัวอย่าง โปรดดูขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างสำหรับภายในเซลล์ทั้งหมด การสอบวิเคราะห์ LDH)

2) การตรวจหา LDH ภายในเซลล์ทั้งหมด

ก. การเพาะเซลล์: เซลล์ได้รับการฉีดวัคซีนในแผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์ 96- หลุมที่มีความหนาแน่นที่เหมาะสม และสามารถตั้งค่ากลุ่มย่อยได้หลายกลุ่มตามความต้องการในการทดลอง

ข. การบำบัดเซลล์: ตามการออกแบบการทดลอง ให้ใช้สื่อที่ประกอบด้วยยาหรือปราศจากยา (อาจมีซีรั่ม) เพื่อฟักเซลล์

ค. การสลายเซลล์: หลังจากถึงเวลาที่กำหนดไว้ ให้นำตัวกลางเดิมออก ล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง เติมสารละลายสำหรับการสลายเซลล์ 120 μL (สารละลายการสลายเซลล์ 10 เท่า เจือจาง 10 ครั้งด้วย PBS) และบ่มในตู้ฟักเป็นเวลา {{3 }} นาที ;

ง. การเก็บตัวอย่าง: ปั่นเหวี่ยงเพลตเพาะเซลล์ที่ 1,000× กรัมเป็นเวลา 5 นาที และเติมส่วนลอยเหนือตะกอนของไลซิส 80 ไมโครลิตรลงในเพลตหลุม 96- ใหม่ ตามด้วยการทดสอบ

3) (ทางเลือก) การเตรียมตัวอย่างมาตรฐาน LDH

หากต้องการปริมาณสัมบูรณ์ของการทำงานของเอนไซม์ LDH ให้ซื้อมาตรฐาน LDH ทีละรายการและเตรียมมาตรฐาน LDH ที่ความเข้มข้นต่างกัน: 10 mU/mL, 5 mU/mL, 2.5mU/mL, 1.25 mU/mL, {{8 }}.65 มิลลิยู/มิลลิลิตร และ 0 มิลลิยู/มิลลิลิตร ที่ 80 ไมโครลิตรต่อหลุม เกรเดียนต์ถูกเติมไปยังจานหลุม 96-

2. การตรวจจับ LDH:

1) ตามจำนวนตัวอย่างที่จะทดสอบ โปรดดูตารางด้านล่างเพื่อเตรียมโซลูชันการตรวจจับ LDH ในปริมาณที่เหมาะสม

หมายเหตุ: สอดคล้องกับ 96-จานหลุม และสำหรับข้อกำหนดอื่นๆ ของจานหลุมสามารถปรับได้ตามต้องการ)

 

	1 ตัวอย่าง	10 ตัวอย่าง	20 ตัวอย่าง	50 ตัวอย่าง
พื้นผิวปฏิกิริยา	20 μL	200 μL	400 μL	1 มล
ไอเอ็นที โซลูชั่น	2 μL	20 μL	40 μL	100 μL
สารละลายเอนไซม์	3 μL	30 μL	60 μL	150 μL
บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา	55 μL	550 μL	1.1 มล	2.75 มล
ปริมาณรวม	80 μL	800 μL	1.6 มล	4 มล

 

2) เพิ่มสารละลายทำงาน 80 μL LDH ลงในส่วนลอยเหนือตะกอน 80μL ใน 96-เพลตหลุมที่เตรียมไว้ในขั้นตอนที่ 1 (Vsample:สารละลายทำงานการตรวจจับ VLDH=1:1) ผสมโดยการแตะเบาๆ

3) เซลล์ถูกบ่มในตู้เพาะเลี้ยงเซลล์, ป้องกันจากแสงเป็นเวลา 30 นาที หรือห่อด้วยกระดาษฟอยล์ดีบุกและบ่มบนเชคเกอร์แนวนอนเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง

4) วัดการดูดกลืนแสงของส่วนควบคุมและตัวอย่างทั้งหมดด้วยเครื่องอ่านเพลทที่ 490 นาโนเมตร ความยาวคลื่นอ้างอิงควรเป็น 600 นาโนเมตรหรือมากกว่า

3. การคำนวณผลลัพธ์ LDH:

1) การสอบวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ LDH (การปลดปล่อย) เป็นประจำ:

ก. ลบ OD490 ของการควบคุมพื้นหลังออกจาก OD490 ของการควบคุมตัวอย่าง การควบคุมการทำงานของเอนไซม์สูงสุดของตัวอย่าง หลุมตัวอย่างที่ได้รับการบำบัด ฯลฯ และใช้สำหรับการคำนวณในภายหลัง

ข. การคำนวณความเป็นพิษต่อเซลล์หรืออัตราการตาย (%)=(OD490 ของตัวอย่างที่ได้รับการบำบัด - OD490 ของการควบคุมตัวอย่าง) / (OD490 ของการออกฤทธิ์ของเอนไซม์สูงสุดของการควบคุมตัวอย่าง - OD490 ของการควบคุมตัวอย่าง) × 100%

2) การหาปริมาณสัมพัทธ์ของการทำงานของเอนไซม์ LDH (ตามผลการคำนวณ สามารถเปรียบเทียบได้ว่ามีความแตกต่างทางสถิติระหว่างกลุ่มการรักษาตัวอย่างต่างๆ หรือไม่ เป็นต้น):

ก. กำหนด OD490 ของความเข้มข้นที่ทราบของมาตรฐาน LDH

ข. กิจกรรม LDH ของตัวอย่างที่จะทดสอบ (mU/mL)=(OD490 ของหลุมตัวอย่าง - OD490 ของหลุมควบคุมพื้นหลังว่างเปล่า) / (OD490 ของผลิตภัณฑ์มาตรฐาน - OD490 ของหลุมควบคุมพื้นหลังที่ว่างเปล่า) × ความเข้มข้นมาตรฐาน (mU /มล.)

3) การหาปริมาณสัมบูรณ์ของการทำงานของเอนไซม์ LDH:

ก. วัด OD490 ของผลิตภัณฑ์มาตรฐานการไล่ระดับสี LDH ชุดหนึ่ง วาดเส้นโค้งมาตรฐานตามค่าการดูดกลืนแสงที่ได้รับ และคำนวณสูตรแนวโน้ม: Y(OD490)=A×หน่วยกิจกรรม LDH (mU)+B, แนวโน้มสามารถคำนวณได้โดยซอฟต์แวร์เช่น Excel ความชันและจุดตัดของเส้น

ข. กิจกรรม LDH ในระบบการตรวจจับ (mU)=(หลุมตัวอย่าง OD490-หลุมควบคุมว่างพื้นหลัง OD490-B)/A

ค. การทำงานของ LDH ของตัวอย่าง (mU/mL)=การทำงานของ LDH ในระบบการตรวจจับ (mU) / ปริมาตรการตรวจจับ (มล.)

 

 

1. ความหนาแน่นของเซลล์ไม่ควรเกิน 85% ขึ้นไป ปัจจัยต่างๆ เช่น สภาพของเซลล์และความหนาแน่นของเซลล์จะมีผลกระทบต่อการปล่อย LDH ของเซลล์ และได้เตรียมตัวอย่างไว้แล้วให้ลองทดสอบให้เสร็จสิ้น ในวันเดียวกันห้ามแช่แข็ง

2. เซรั่มประกอบด้วยแลคเตตดีไฮโดรจีเนส ขอแนะนำให้ใช้เซรั่มที่ไม่มีเซรั่มหรือเซรั่มต่ำ หากคุณต้องใช้เซรั่ม 10% โปรดตั้งค่ากลุ่มควบคุมที่ไม่มีเซลล์เพื่อกำจัดการรบกวนในพื้นหลัง

3. การดำเนินการนั้นอ่อนโยนที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้และควรหลีกเลี่ยงฟองอากาศเพื่อไม่ให้ส่งผลกระทบต่อผลการทดลอง

4. เพื่อความปลอดภัยและสุขภาพของคุณ โปรดสวมแว่นตานิรภัย ถุงมือ หรือชุดป้องกัน

 

สำหรับใช้ในการวิจัยเท่านั้น!

 

 

ป้ายกำกับยอดนิยม: ชุดทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ ldh ประเทศจีนผู้ผลิตชุดทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ ldh ซัพพลายเออร์ โรงงาน