คัลซิน AM

 

ชื่อสินค้า	แมว.เลขที่.	ข้อมูลจำเพาะ..
คัลซิน AM	ก1728-0.1ML	0.1 มล

 

 

Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester) มีพื้นฐานมาจาก Calcein ด้วยการแนะนำกลุ่ม acetoxymethyl ester (AM) ซึ่งจะเพิ่มความสามารถในการไม่ชอบน้ำ จึงสามารถทะลุผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้อย่างง่ายดาย Calcein AM นั้นเป็นสารประกอบที่ซึมผ่านเซลล์ได้ ไม่เรืองแสง และไม่ชอบน้ำ ซึ่งเมื่อเข้าสู่เซลล์จะถูกไฮโดรไลซ์โดยเอสเทอเรสภายนอกในเซลล์เพื่อผลิตโมเลกุลขั้วโลกที่มีประจุลบอย่างรุนแรง Calcein ซึ่งไม่สามารถซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้ และด้วยเหตุนี้ ยังคงอยู่ภายในเซลล์ ในขณะที่ Calcein (ความยาวคลื่นการกระตุ้นสูงสุด: 494 นาโนเมตร; ความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุด: 517 นาโนเมตร) สามารถปล่อยสีเขียวเข้มออกมาได้ เรืองแสง เมื่อเปรียบเทียบกับโพรบอื่นๆ ที่คล้ายคลึงกัน (เช่น BCECF AM และ CFDA AM) ปัจจุบัน Calcein AM เป็นหนึ่งในโพรบฟลูออเรสเซนต์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการย้อมสีเซลล์ที่มีชีวิต เนื่องจากมีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำมาก แทบไม่มีผลกระทบต่อการทำงานของเซลล์ เช่น การเพิ่มจำนวนเซลล์หรือเคมีบำบัดของลิมโฟไซต์ และความไวต่อ pH ต่ำ

เนื่องจากขาดเอสเทอเรสในเซลล์ที่ตายแล้ว Calcein AM จึงใช้สำหรับการทดสอบความมีชีวิตและการติดฉลากเซลล์ที่มีชีวิตในระยะสั้นเท่านั้น สีย้อมกรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีแดง Propidium Iodide (PI) ไม่สามารถทะลุผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่มีชีวิต แต่จะผ่านบริเวณที่ไม่เป็นระเบียบของเยื่อหุ้มเซลล์ที่ตายแล้วไปยังนิวเคลียสและฝังตัวเองไว้ในเกลียวคู่ DNA ของเซลล์เพื่อสร้างสารเรืองแสงสีแดง ( การกระตุ้น: 535 นาโนเมตร การปล่อยก๊าซ: 617 นาโนเมตร) ดังนั้น PI จึงคราบเฉพาะเซลล์ที่ตายแล้ว Calcein AM มักใช้ร่วมกับโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) สำหรับการย้อมเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้วพร้อมกันด้วยฟลูออเรสเซนซ์คู่ เนื่องจากทั้ง Calcein และ PI-DNA สามารถตื่นเต้นได้ที่ 490 นาโนเมตร เซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้วจึงสามารถสังเกตได้พร้อมกันด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ด้วยการกระตุ้นที่ 545 นาโนเมตร จึงสามารถสังเกตได้เฉพาะเซลล์ที่ตายแล้วเท่านั้น

Calcein AM สามารถใช้ได้ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมส่วนใหญ่ มีการแสดงให้เห็นว่า Calcein AM สามารถใช้ในเซลล์พืชบางชนิดได้ เช่น เซลล์ที่มีลักษณะคล้ายขอบรากของ Arabidopsis และยีสต์บางชนิด เช่น Pichia anomala และ Saccharomyces cerevisiae ปรสิตบางชนิด เช่น ลิชมาเนีย ไม่สามารถเข้าไปในเซลล์ที่มีชีวิตได้เนื่องจากส่วนประกอบของเยื่อหุ้มเซลล์ แต่ Calcein AM สามารถเข้าไปในเซลล์ปรสิตได้ในระยะแรกของการตายของเซลล์ และด้วยเหตุนี้จึงใช้ร่วมกับ PI ในการตรวจหาปรสิตในระยะแรกของการตายของเซลล์ Calcein AM ไม่เหมาะสำหรับการใช้กับเชื้อราและแบคทีเรียเนื่องจากมีผนังเซลล์ที่ป้องกันไม่ให้ Calcein AM เข้าสู่เซลล์

ตัว Calcein เองเป็นตัวบ่งชี้การเกิดสารประกอบเชิงซ้อนของโลหะ และสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะดับลงเมื่อเกิดปฏิกิริยาเชิงซ้อนกับไอออนของโลหะ เช่น Co²⁺, นิ²⁺, คิว²⁺, เฟ³⁺และมน²⁺ที่ pH ทางสรีรวิทยา ทำให้ Calcein AM ยังเป็นหัววัดเรืองแสงสีเขียวที่สามารถใช้เพื่อระบุรูพรุนที่เปลี่ยนการซึมผ่านของไมโตคอนเดรียได้

ผลิตภัณฑ์ Calcein AM นี้มีความบริสุทธิ์สูงและละลายใน DMSO แบบปราศจากน้ำที่ความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้นสุดท้ายของ Calcein AM ที่ใช้กันทั่วไปคือ 0.1-5.0 μM เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการมากขึ้น โปรดปรับความเข้มข้นสุดท้ายของ Calcein ให้เหมาะสมตามประเภทเซลล์และสถานการณ์จริงของการทดลอง

 

 

-20 องศาสำหรับการจัดเก็บและการขนส่ง มีอายุ 12 เดือน

 

 

ส่วนประกอบ	G1728-0.1ML
คัลซิน AM	0.1 มล
คู่มือ	1 ชิ้น

 

 

มีการเตรียมสารละลายสำหรับการย้อมสี Calcein AM:

เจือจางผลิตภัณฑ์ด้วยบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรั่ม, HBSS (G4203) หรือ PBS (G4202) เพื่อเตรียมสารละลายสำหรับการย้อมสี Calcein AM ที่ความเข้มข้น ของ 0.1-5.0 µM

หมายเหตุ: แนะนำให้ปรับความเข้มข้นสุดท้ายของ Calcein AM ให้เหมาะสมตามประเภทเซลล์และความเป็นจริงของการทดลอง

 

ขั้นตอน

1. การทดสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หรือการทดสอบไซโมกราฟีเรืองแสงสำหรับเซลล์แขวนลอย:

ก) เซลล์ถูกนับหลังจากการบำบัดบางอย่างตามการออกแบบการทดลอง นำเซลล์ที่เหมาะสมมาปั่นแยกที่ 250×g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ทิ้งส่วนเหนือตะกอนออก แล้วเติมสารละลายย้อมสี Calcein AM ในปริมาตรที่เหมาะสมเพื่อทำให้เซลล์มีความหนาแน่นประมาณ 1×10⁶/มล.

b) ฟักเซลล์ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30-45 นาที เวลาฟักไข่ที่เหมาะสมจะแตกต่างกันสำหรับเซลล์ต่างๆ พิจารณาเวลาฟักตัวเริ่มต้น 30 นาที และปรับให้เหมาะสมตามสถานการณ์การทดลองเฉพาะเพื่อให้ได้ผลลัพธ์การตรวจจับที่เหมาะสมยิ่งขึ้น

ค) เมื่อสิ้นสุดการฟักตัว ปั่นแยกที่ 250×g เป็นเวลา 5 นาที ดูดส่วนที่ลอยออกไป และค่อยๆ แขวนเซลล์กลับคืนโดยเติมอาหารเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37°C ที่อุ่นไว้ล่วงหน้า

d) ทำซ้ำขั้นตอน c สองครั้งขึ้นไปเพื่อล้างอย่างเพียงพอเพื่อขจัดคราบที่ตกค้าง

จ) เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อสดที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่อุณหภูมิ 37°C และฟักที่อุณหภูมิ 37°C ให้ห่างจากแสงอีก 30 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าเอสเทอเรสในเซลล์ไฮโดรไลซ์ Calcein AM อย่างเพียงพอเพื่อสร้าง Calcein ที่มีแสงเรืองแสงสีเขียว

f) เซลล์ถูกปั่นแยกที่ 250×g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง อาหารเลี้ยงเชื้อส่วนใหญ่ถูกดูดเข้าไป และเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหลือและทาป้าย จากนั้นสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หรือตรวจพบโดยสารเรืองแสง zymography ความยาวคลื่นการกระตุ้นสูงสุดของ Calcein คือ 494 nm และความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุดคือ 514 nm หากจำเป็น อื่น ๆ สามารถทำการย้อมสีเรืองแสงซ้ำได้ และควรหลีกเลี่ยงกระบวนการทั้งหมดโดยการใช้แสง

 

2. การทดสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงของเซลล์สานุศิษย์หรือการทดสอบการติดฉลากเอนไซม์เรืองแสง:

ก) เซลล์ถูกเพาะเชื้อบนจานเพาะเชื้อ แผ่นเพาะเลี้ยงเซลล์หลายหลุม หรือโปรแกรมรวบรวมข้อมูลเซลล์ และบำบัดด้วยวิธีบางอย่างตามการออกแบบการทดลอง

b) ดูดสารละลายเพาะเลี้ยงและล้างเซลล์ 1-2 ครั้งด้วย PBS

c) เติม Calcein AM Staining Solution ในปริมาณที่เหมาะสม และเขย่าเบาๆ เพื่อให้สีย้อมครอบคลุมเซลล์ทั้งหมดเท่าๆ กัน โดยทั่วไป ปริมาตรของ 96-จานหลุมคือ 100 ul ต่อหลุม 24-จานหลุมคือ 250 ul ต่อหลุม 12-จานหลุมคือ 500 ul ต่อหลุม และ 6- จานหลุมคือ 1 มล. ต่อหลุม

ง) ฟักตัวที่ 37°C เป็นเวลา 30-45 นาที เวลาฟักไข่ที่เหมาะสมจะแตกต่างกันไปในแต่ละเซลล์ ใช้เวลาฟักตัวเป็นเวลา 30 นาที และปรับเวลาฟักตัวให้เหมาะสมตามเซลล์ที่ใช้เพื่อให้ได้ผลการย้อมสีที่เหมาะสมที่สุด

จ) เมื่อสิ้นสุดการฟักตัว อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่อุณหภูมิ 37°C และบ่มที่ 37°C ให้ห่างจากแสงอีก 30 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าเอสเทอเรสในเซลล์ไฮโดรไลซ์ Calcein AM อย่างเพียงพอเพื่อผลิต Calcein ด้วยการเรืองแสงสีเขียว .

f) ดูดของเหลวเพาะเลี้ยง ล้างด้วย PBS เป็นเวลา 2-3 ครั้ง จากนั้นเติมของเหลวเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ไม่มีซีรั่ม โดยสามารถสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ หรือตรวจพบโดยเครื่องหมายของเอนไซม์ฟลูออเรสเซนต์ แคลซีนมีความยาวคลื่นการกระตุ้นสูงสุดที่ 494 นาโนเมตรและความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุด 514 นาโนเมตร และสามารถย้อมสีเพิ่มเติมด้วยฟลูออเรสเซนต์อื่นๆ ได้หากต้องการ เพื่อรักษากระบวนการทั้งหมดให้ห่างจากแสง

 

3. การสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี:

ก) หลังจากการย่อยทริปซินของเซลล์ที่เกาะติด ให้แขวนเซลล์ใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อ แขวนเซลล์เพื่อใช้โดยตรง นับ ปั่นแยกเซลล์ในปริมาณที่เหมาะสมที่ 250×g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอน และเพิ่มสิ่งที่เหมาะสม ปริมาตรของสารละลายในการย้อมสี Calcein AM เพื่อให้เซลล์เป็นสารแขวนลอยเซลล์เดียวและความหนาแน่นของเซลล์อยู่ที่ประมาณ 1×106 /มล. โดยมีปริมาตร 1 มล. สำหรับแต่ละตัวอย่าง หมายเหตุ: จำเป็นต้องเตรียมตัวอย่างเฉพาะบัฟเฟอร์ของเซลล์เพื่อใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบในการสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี การควบคุมเชิงลบสำหรับการสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี และเป็นที่พึงปรารถนาที่จะรักษาบัฟเฟอร์นี้เหมือนกับบัฟเฟอร์ที่ใช้ในการเตรียมสารละลายการย้อมสี Calcein AM

b) ฟักไข่เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C ให้ห่างจากแสง

c) หลังจากการฟักตัวเสร็จสิ้น เซลล์จะถูกรวบรวมโดยการปั่นแยกที่ 250 × g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เติมบัฟเฟอร์ 1 มิลลิลิตรต่อตัวอย่าง ค่อยๆ แขวนลอยอีกครั้ง และเก็บเซลล์โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 250×กรัม เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หมายเหตุ: ขั้นตอนนี้จะขจัดสีย้อมและรีเอเจนต์ส่วนเกินที่อาจทำให้เกิดการเรืองแสงดับลง

d) แขวนเซลล์ใหม่ด้วยบัฟเฟอร์ 400 ไมโครลิตร นอกจากนี้ยังสามารถทำการย้อมสีเพิ่มเติมได้หากจำเป็น โปรดทราบว่ากระบวนการทั้งหมดควรทำให้ห่างจากแสง หลังจากการย้อมสี ตัวอย่างจะถูกวางบนน้ำแข็งและสามารถตรวจจับและวิเคราะห์การไหลแบบไซโตเมทริกได้ภายใน 1 ชั่วโมง

e) โปรดทราบว่าตัวอย่างเซลล์แบบบัฟเฟอร์เท่านั้นและไม่มีการย้อมสีถูกนำมาใช้สำหรับการตั้งค่าการควบคุมเชิงลบของโฟลว์ไซโตมิเตอร์ Calcein มีความยาวคลื่นการกระตุ้นสูงสุด 494 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุด 514 นาโนเมตร

 

 

1. สีย้อมฟลูออเรสเซนต์ทั้งหมดมีปัญหาในการดับ และต้องระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงแสงให้มากที่สุดเพื่อชะลอการดับฟลูออเรสเซนต์

2. Calcein AM มีความไวต่อความชื้นมากและมีแนวโน้มที่จะสลายตัวในสภาพแวดล้อมที่มีความชื้น ดังนั้นสารละลาย Calcein AM จึงต้องปิดฝาให้แน่นหลังการดึงออกแต่ละครั้ง แนะนำให้เก็บในบรรจุภัณฑ์ที่ปิดสนิทแยกกันตามขนาดยาเดียว อย่าใช้ปิเปตทิปที่มีน้ำ

3. เนื่องจาก Calcein AM ไม่เสถียรในสารละลายที่เป็นน้ำ เช่น PBS จึงต้องเตรียมและใช้สารละลายสำหรับการย้อมสีทันที

4. เซรั่มและฟีนอลเรดในอาหารเลี้ยงเชื้อมีผลต่อการย้อมสี Calcein AM และแนะนำให้ล้างเซลล์อย่างเพียงพอก่อนเติมสารละลายการทำงานของ Calcein AM

5. เซลล์ที่มีป้ายกำกับ Calcein AM ซึ่งมีการเรืองแสงสม่ำเสมอเป็นทางเลือกที่ดีสำหรับการติดตามเซลล์และการย้อมสีไซโตพลาสซึมทั่วไป อย่างไรก็ตาม มันไม่ได้จับกับสิ่งใดๆ และอาจถอนตัวออกจากเซลล์อย่างแข็งขันภายในไม่กี่ชั่วโมง และการกักเก็บแคลเซียมภายในเซลล์ที่มีชีวิต ขึ้นอยู่กับลักษณะโดยธรรมชาติของชนิดเซลล์และสภาวะการเพาะเลี้ยง

6. การย้อมสี Calcein AM ไม่ควรตามมาด้วยการตรึงอัลดีไฮด์ มิฉะนั้น Calcein จะสูญหายไปในระหว่างการตรึง นอกจากนี้ การรบกวนของพลาสมาเมมเบรน (เช่น สารขจัดตะกรันหรือการบำบัดทริปซิน) จะส่งผลให้สีย้อมรั่วไหลออกจากเซลล์

7. หาก Calcein AM เข้าสู่เซลล์ได้ยาก สามารถใช้สารลดแรงตึงผิว เช่น Pluronic F127 ได้ สามารถใช้สารละลาย Calcein AM ที่ความเข้มข้น 1/10 แทนอาหารเลี้ยงเชื้อได้

8. ผลิตภัณฑ์นี้จำกัดเฉพาะการใช้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์โดยผู้เชี่ยวชาญ และห้ามใช้สำหรับขั้นตอนการวินิจฉัยหรือการรักษา อาหารหรือยา หรือเก็บไว้ในที่อยู่อาศัยทั่วไป

9. เพื่อความปลอดภัยและสุขภาพของคุณ โปรดสวมเสื้อกาวน์แล็บและถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง

 

สำหรับใช้ในการวิจัยเท่านั้น!

 

 

ป้ายกำกับยอดนิยม: calcein am ผู้ผลิต calcein am ซัพพลายเออร์ โรงงาน